熒光體式顯微鏡的性能介紹
發(fā)布人：shpuda發(fā)布時(shí)間：2014/4/24
前面介紹的明視野、暗視野、相差體式顯微鏡都是用發(fā)自光源的可見(jiàn)光對(duì)樣品進(jìn)行照明和成像，因此觀察到的是標(biāo)本直接的本色。而熒光顯微鏡觀察的物像是由樣品被激發(fā)后發(fā)出的熒光形成的，光源的作用僅僅是作為樣品熒光的橄發(fā)光，不進(jìn)人目鏡用于物像的生成。
某些物質(zhì)可以吸收輻射能而被滋發(fā)，并在稍后以波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光能形式將所吸收的大部分能量釋放出來(lái)，這種波長(zhǎng)長(zhǎng)于激發(fā)光的可見(jiàn)光就是熒光。微生物細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)的某些物質(zhì)在紫外線或藍(lán)縈光的激發(fā)下會(huì)自發(fā)地產(chǎn)生熒光，可直接使用熒光體式顯微鏡進(jìn)行觀察。而自身不產(chǎn)生熒光的標(biāo)本，則需經(jīng)熒光染料(熒光素)染色后再進(jìn)行觀察。由于不同熒光索被滋發(fā)后的熒光波長(zhǎng)范圍會(huì)有差異，因此同一樣品在需要的時(shí)候可以用兩種以上的熒光素標(biāo)記，從而在熒光體式顯微鏡下經(jīng)過(guò)一定波長(zhǎng)的光激發(fā)后顯示不同的顏色，方便對(duì)樣品特定部位或成分的定位、定量觀察和分析。
按照激發(fā)光光源光路與觀察標(biāo)本相對(duì)位置的不同，熒光體式顯微鏡可分為透射式和落射式兩種。透射式熒光顯微鏡的光源光線是通過(guò)聚光器穿過(guò)標(biāo)本材料來(lái)激發(fā)熒光，因此低倍鏡時(shí)熒光強(qiáng)，而隨故大倍數(shù)增加其熒光減弱，所以對(duì)觀察較大的標(biāo)本材料較好。此外，由于它的激發(fā)光束必須穿過(guò)載物玻片，為了減少滋發(fā)光線的損失，觀察時(shí)需使用價(jià)格昂貴的石英玻璃級(jí)玻片，也不能用于觀察非透明的被檢物體。與之相比，落射熒光體式顯微鏡的激發(fā)光路不經(jīng)過(guò)毅玻片而直接照射在標(biāo)本上，橄發(fā)光的損失小，熒光效應(yīng)離，還能對(duì)非透明的標(biāo)本進(jìn)行觀察。目前透射式熒光體式顯微鏡已經(jīng)越來(lái)越少，大多數(shù)熒光顯微鏡都采用落射式進(jìn)行熒光滋發(fā)。
正置落射熒光體式顯微鏡的基本光路圖。其特點(diǎn)是光源通過(guò)物鏡落射于樣品，激發(fā)產(chǎn)生的熒光再通過(guò)物鏡進(jìn)人目鏡，因此放大倍數(shù)越大熒光越強(qiáng)，視野照明均勻，成像清晰。光路中激發(fā)漣鏡的作用是濾掉來(lái)自高壓汞燈的雜光，僅讓特定波長(zhǎng)的激發(fā)光透過(guò)。光路中的二分色鏡由鍍膜的光學(xué)玻璃制成，兼有透射長(zhǎng)波光線和反射短波光線的功能，其鏡面方位與激發(fā)光和熒光的光軸交角均呈45℃，可將短波長(zhǎng)的激發(fā)光向下反射，通過(guò)物鏡投射向載玻片上的標(biāo)本，激發(fā)釋放出的熒光通過(guò)物鏡，穿過(guò)二分色鏡和目鏡即可進(jìn)行觀察。目鏡下方安下的阻斷濾鏡只允許特定波長(zhǎng)的熒光通過(guò)，以保護(hù)觀察者的眼晌并降低視野亮度，由于每種熒光物質(zhì)都有一個(gè)產(chǎn)生最強(qiáng)熒光的激發(fā)光波長(zhǎng)，被激發(fā)產(chǎn)生的熒光也具有專一性，因此在實(shí)際使用時(shí)阻斷旅鏡應(yīng)根據(jù)需要和激發(fā)濾鏡配合使用。換用不同的激發(fā)濾鏡/阻斷濾鏡的組合插塊，可滿足不同熒光反應(yīng)產(chǎn)物的需要。
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